2008-05-16
1 實驗目的
重組高效抗腫瘤抗病毒蛋白的體外抗腫瘤活性測定方法，是采用Daudi細胞和WST-1試劑盒。由于Daudi細胞內(nèi)有EB病毒，有實驗操作人員安全顧慮。另外WST-1是進口試劑盒，不是常規(guī)、國內(nèi)外均認可的試劑盒，價格比較貴，方法穩(wěn)定性差。因此試圖建立國內(nèi)外認可、方便和可靠的測定腫瘤細胞增殖活性方法，應該比較有意義。
磺酰羅丹明B (sulforhodamine B，SRB)是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料，粉紅色，可溶于水?？梢耘c經(jīng)三氯乙酸固定后的細胞蛋白的堿性氨基酸結(jié)合而顯色，顯現(xiàn)一種明亮的粉紅色，其在515 nm波長的OD讀數(shù)與細胞數(shù)呈良好的線性關系，故可用作細胞數(shù)的定量。
本研究通過SRB法，觀察Novaferon對人大腸癌細胞LS180的體外增殖抑制程度，并與IFNα-2b的活性比較，測定Novaferon的抑制腫瘤細胞增殖活性，并分析本方法作為活性測定方法的適用性。
2 實驗材料
2.1細胞株
人結(jié)直腸癌細胞株LS180，培養(yǎng)液為高糖DMEM。
2.2 樣品
（1）受試品
名 稱：重組高效抗腫瘤抗病毒蛋白（Novaferon）
提供單位：杰華生物技術（北京）有限公司
批 號：A20071201
純 度：大于98%
比 活：3×109 IU/mg
濃 度：1.1 mg/ml
稀 釋 液：含10%血清的培養(yǎng)液
（2）對照品
名 稱：IFNα-2b
提供單位：杰華生物技術（北京）有限公司
批 號：A20070913
濃 度：1.17mg/ml
純 度：大于98%
稀 釋 液：含10%血清的培養(yǎng)液
2.3 試劑
SRB（Sigma）、50%TCA，10mmol/l Tris(PH=10.5)，96孔板（Costar）。
3 實驗方法
對數(shù)生長期的細胞消化后計數(shù)，調(diào)整細胞的密度為2×104/ ml，按照100µl/孔加入96孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)過夜。加入不同濃度Novaferon、 IFNa-2b100µl/孔，Novaferon、 IFNa-2b的作用終濃度為100000、10000、1000、100、10、1、0.1、0.01 、0.001、0.0001 ng/ml，混勻，37℃，5%CO2培養(yǎng)。6天后，加入預冷的50%TCA 50µl/孔，4℃固定1小時，棄固定液，去離子水洗5遍，空氣干燥。每孔加入100µl SRB染色液，室溫染色10分鐘。棄染色液，用1%醋酸洗5遍，空氣干燥，每孔加入150µl 10mmol/l Tris溶解SRB，酶標儀OD540讀數(shù)。
4 實驗結(jié)果與討論
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Novaferon在1ng/ml以上濃度，其對腫瘤細胞的抑制率均接近70-80%，無明顯差別，說明抑制作用接近飽和。隨濃度降低，Novaferon抑制腫瘤細胞增殖活性下降,而對照品FN α-2b在100ng/ml以上濃度，其對腫瘤細胞的抑制作用較強，Novaferon對腫瘤細胞的抑制作用明顯強于對照品IFN α-2b。對三批試驗的結(jié)果擬合出IC50并相比較，結(jié)果表明Novaferon的活性較對照品IFN α-2b強272、282、251倍，平均268倍（具體結(jié)果見后面的附件）。
在建立本試驗方法過程中，針對LS180細胞株的生長特點和干擾素類藥物的作用特點（以抑制增殖為主），對檢測體系進行了摸索，包括接種細胞數(shù)量和培養(yǎng)時間等，相對而言，目前的實驗方法比較適用，但也不排除通過進一步優(yōu)化實驗條件（選擇更靈敏的腫瘤細胞株等），可增加實驗的靈敏度。
體外抗腫瘤細胞活性測定方法比較多，主要有細胞直接計數(shù)法、3H-TdR摻入法、MTT法以及SRB法。直接計數(shù)法操作簡便，但主觀性較大，費力，目前已不多用；3H-TdR摻入法靈敏度較高，但需要特殊的儀器設備，還存在著同位素污染問題。MTT法簡便、快速，研究結(jié)果穩(wěn)定，重復性好，目前應用較多，但MTT法靈敏度稍差，OD值可隨放置時間而變。
美國腫瘤研究所（National Caner Institute，NCI）的研究結(jié)果顯示，SRB法比MTT比色法進行腫瘤藥物敏感試驗有一定優(yōu)越性。有人1991年對SRB法與MTT法在不同的人類腫瘤細胞等對化療藥物敏感性方面進行了比較，認為SRB法比MTT法提供了更好的與細胞數(shù)量之間的線性關系和更高度的敏感性，細胞碎片不能被SR染色，因而藥物敏感性也不受影響。進一步研究認為，SRB法比MTT法更靈敏，若一孔中僅有150個細胞，用SRB法可以檢測出，而MTT法卻測不出。國內(nèi)用SRB顯色法檢測抗癌藥物的敏感性，結(jié)果與國外報導相符,認為實驗時間比MTT更短，樣品易保存，操作簡便，方法靈敏，數(shù)據(jù)客觀，穩(wěn)定性和重復性好，無同位素污染。
5 參考文獻
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