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摘    要

    重組高效抗腫瘤抗病毒蛋白（Novaferon）是采用基因穿梭法篩選獲得、具有干擾素樣活性、與人干擾素高度同源的新型重組蛋白質(zhì)。本項(xiàng)目從體內(nèi)外抗腫瘤效應(yīng)、體外抗HIV、HBV和H5N1效應(yīng)、抗血管新生、對(duì)正常猴骨髓細(xì)胞增殖的影響、食蟹猴初步毒性和免疫原性、抗腫瘤機(jī)制及對(duì)腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)譜的作用等方面進(jìn)行了系列研究，并與已上市的HuIFNα-2b（甘樂能）進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果如下：
1. 體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(1)樂復(fù)能對(duì)多數(shù)實(shí)體瘤細(xì)胞株有明顯的增殖抑制作用，對(duì)黑色素瘤細(xì)胞和大腸癌細(xì)胞的抑制作用尤為顯著；對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤Daudi和Ramos細(xì)胞株的生長抑制作用極其顯著，在1pg/ml濃度時(shí)其抑制率大于50%。（2）與HuIFNα-2b相比，樂復(fù)能對(duì)多數(shù)實(shí)體瘤細(xì)胞株的抑制效果更加明顯，達(dá)到同樣抑制效果的濃度低10-1000倍。（3）與常用的周期特異性化療藥物5-FU伍用，能顯著增強(qiáng)樂復(fù)能的抑瘤作用，尤其是在5-FU作用2天時(shí)抑瘤作用非常顯著，明顯優(yōu)于HuIFNα-2b，呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。（4）樂復(fù)能與腫瘤細(xì)胞作用7天的結(jié)果顯示：0.1ng/ml 樂復(fù)能的抑瘤率達(dá)80.5%，而相同濃度樂復(fù)能作用3天時(shí)的抑瘤率僅為10.5%。HuIFNα-2b在此濃度下作用7天的抑瘤率不及10％。
2. 體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)：樂復(fù)能對(duì)裸鼠接種前列腺癌細(xì)胞株（PC-3）、肝癌細(xì)胞株HepG2、結(jié)直腸癌細(xì)胞株LS180、人白血病細(xì)胞株HL-60（S）和黑色素瘤細(xì)胞株A357的生長有明顯抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系。2.5×106 IU/kg或12.5µg/kg的樂復(fù)能對(duì)上述裸鼠移植瘤即有顯著的抗腫瘤活性。同劑量樂復(fù)能的抗腫瘤效果明顯優(yōu)于對(duì)照品HuIFNα-2b。（見圖 B-1、B-2）
3. 體外抗血管新生作用研究發(fā)現(xiàn)：樂復(fù)能對(duì)人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）生長有明顯的抑制作用，且優(yōu)于HuIFNα-2b；沙利度胺的作用較強(qiáng)，但有效劑量較大，僅在130µg/ml時(shí)作用較強(qiáng)，而65µg/ml時(shí)的作用弱于樂復(fù)能，與樂復(fù)能 1ng/ml時(shí)的作用相當(dāng)；樂復(fù)能、HuIFNα-2b和目前公認(rèn)的血管內(nèi)皮抑制劑Endostatin均能抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的HUVEC的遷移，但以樂復(fù)能的作用最明顯；樂復(fù)能和HuIFNα-2b均能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的小血管形成，而樂復(fù)能的作用更加顯著。（見表B-1）

圖 B-1. 荷瘤裸鼠體內(nèi)治療對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果（PC-3細(xì)胞）

 圖B-2. 樂復(fù)能對(duì)裸鼠體內(nèi)PC-3細(xì)胞移植瘤的影響

模型對(duì)照組為空白對(duì)照組，受試品組為樂復(fù)能治療組。圖中可見，經(jīng)過30天的樂復(fù)能治療，無論是高劑量組還是低劑量組，裸鼠體內(nèi)的腫瘤均小于對(duì)照組，高劑量組抑瘤效果尤為明顯。由此可見，樂復(fù)能對(duì)接種到裸鼠體內(nèi)的前列腺癌細(xì)胞株（PC-3）有強(qiáng)烈的抑制作用。
表B-1 樂復(fù)能對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞小血管形成的影響
藥物                 濃度（ng/ml）          面積（μm2）
細(xì)胞對(duì)照             - 1440.14               ±967.13
樂復(fù)能                2 1463.92                 ±879.78
樂復(fù)能                20 1215.24               ±674.81
樂復(fù)能                200  897.77              ±445.24 *
甘樂能                2 1247.67                ±615.30
甘樂能                20 1266.98              ±640.75
甘樂能                200 1163.61              ±472.31
* 樂復(fù)能對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞小血管形成的抑制作用最為明顯（P<0.05）.

4. 抗腫瘤作用機(jī)制研究結(jié)果顯示：樂復(fù)能可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期使腫瘤細(xì)胞停滯在S期，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用。此效能明顯優(yōu)于HuIFNα-2b。樂復(fù)能激活干擾素信號(hào)通路的活性明顯高于HuIFNα-2b。以HT-29為細(xì)胞模型，利用免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞儀觀察樂復(fù)能對(duì)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133表達(dá)的影響，結(jié)果提示樂復(fù)能能明顯抑制腫瘤干細(xì)胞。
5. 基因表達(dá)譜研究結(jié)果顯示：HuIFNα-2b對(duì)腫瘤基用芯片85條腫瘤相關(guān)基因表達(dá)有明顯的誘導(dǎo)作用，對(duì)109條基因表達(dá)有明顯的抑制作用。同劑量的樂復(fù)能對(duì)175條腫瘤相關(guān)基因表達(dá)有明顯的誘導(dǎo)作用，對(duì)306條基因表達(dá)有明顯的抑制作用。樂復(fù)能與HuIFNα-2b 對(duì)腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)的影響，無論數(shù)量還是表達(dá)變化水平均有明顯差異。HuIFNα-2b與樂復(fù)能對(duì)部分已知干擾素靶基因有調(diào)節(jié)作用，但誘導(dǎo)表達(dá)水平不同。HuINF α-2b對(duì)部分與腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、免疫和抗病毒相關(guān)的基因無抑制或誘導(dǎo)作用。經(jīng)樂復(fù)能處理后，腫瘤細(xì)胞的CRK、HRAS（原癌基因）、BCR等表達(dá)明顯降低，細(xì)胞增殖明顯受到抑制；TNFSF10表達(dá)增加，選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；抗病毒相關(guān)基因表達(dá)增多。此結(jié)果提示：在基因水平上樂復(fù)能具有與 HuIFNα-2b相似的作用，但明顯優(yōu)于后者。
6. 抗乙型肝炎病毒研究發(fā)現(xiàn)：高、中、低濃度的樂復(fù)能都有降低HepG2.2.15細(xì)胞和上清中HBV DNA拷貝數(shù)的作用，并呈劑量依賴關(guān)系。HuIFNα-2b高濃度有效，低濃度無抑制作用。樂復(fù)能的作用優(yōu)于野生型IFN α-2b，即樂復(fù)能有顯著抑制HBV DNA復(fù)制的活性。
7. 抗禽流感病毒研究顯示：樂復(fù)能對(duì)H5N1病毒有一定的抑制作用，在濃度為1ng/ml時(shí)對(duì)H5N1病毒的抑制率達(dá)50%以上。HuINFα－2b對(duì)H5N1病毒也有輕度的抑制作用，效果弱于樂復(fù)能。鹽酸金剛烷胺對(duì)H5N1病毒的抑制率較弱，達(dá)菲對(duì)H5N1病毒的抑制作用不明顯。
8. 抗HIV病毒研究顯示：樂復(fù)能和HuIFNα-2b對(duì)MT4細(xì)胞均有弱的細(xì)胞毒活性，兩者之間無明顯差異。樂復(fù)能能明顯減少病毒（HIV-1 ⅢB株）細(xì)胞病變孔，降低培養(yǎng)上清的P24水平。樂復(fù)能具有顯著的抗HIV-1活性，且明顯優(yōu)于HuIFNα-2b。
9. 對(duì)骨髓細(xì)胞的毒性研究表明：樂復(fù)能對(duì)正常猴骨髓細(xì)胞有輕度的抑制作用，與陽性對(duì)照品HuIFNα-2b的作用相當(dāng)，兩者之間無明顯差別，表明雖然樂復(fù)能的生物活性顯著提高，但對(duì)骨髓的抑制作用并未隨之增強(qiáng)。
10. 食蟹猴皮下注射樂復(fù)能的初步毒性和免疫原性研究結(jié)果顯示：給藥后1周外周血白細(xì)胞數(shù)下降。隨著給藥時(shí)間的延長，未見白細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步降低。其余指標(biāo)未見明顯變化?？贵w檢測(cè)結(jié)果顯示，注射樂復(fù)能可在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體。連續(xù)給藥4周后，樂復(fù)能誘導(dǎo)猴抗體產(chǎn)生，但外周血白細(xì)胞數(shù)仍維持稍低水平，而HuIFNα-2b組動(dòng)物的外周血白細(xì)胞數(shù)已恢復(fù)，初步提示HuIFNα-2b的抗體具中和活性，而樂復(fù)能誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體無明顯中和活性。

綜上所述，樂復(fù)能在體內(nèi)外均具有顯著的抗腫瘤活性，效果明顯優(yōu)于HuIFNα-2b。樂復(fù)能具有體外抗HBV、HIV和H5N1等病毒的活性，此作用明顯強(qiáng)于HuIFNα-2b。樂復(fù)能具有超強(qiáng)、廣譜的抗病毒和多作用機(jī)制的抗腫瘤活性，但骨髓抑制作用并不隨之增加。因此，樂復(fù)能有望成為具有顯著抗腫瘤、抗病毒潛能的生物技術(shù)新藥。

　研究單位：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院